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揭秘CST为什么会用non-phospho非磷酸化抗体来检测功能性蛋白

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发表于 2019-5-20 09:09:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
  今天看到了一个关于磷酸化抗体的实验室小段子,大致是说,初入实验室时,以为研究蛋白的功能就是检测该蛋白的含量。后来知道了蛋白检测不简单,因为看到师兄、师姐还分开检测靶标的磷酸化、总蛋白水平。而当你检测磷酸化蛋白时,却发现CST实验室还检测起非磷酸化靶标!
  
  
  
  CST赛信通关于磷酸化抗体Autophagy Signaling信号通路图
  
  可能很多人都和我一样,不知道非磷酸化抗体和总蛋白也可以是一对CP。今天我就分享一个来自CST的知识点,以β-catenin为例,让你明白为什么CST会用non-phospho抗体来检测功能性蛋白。
  
  
  
  CST赛信通关于磷酸化抗体MAP Kinase Signaling信号通路图
  
  β-Catenin(β-链蛋白)是典型Wnt信号转导通路中的一个关键下游效应分子。在生理状态下,当Wnt信号缺失时(OFF-State),β-catenin作为细胞间黏附接头蛋白和转录共调节分子,与Axin、APC、GSK3β和CK1α形成多蛋白复合体,并被该复合体内的激酶磷酸化,CK1可在Ser45位点磷酸化β-Catenin,随后GSK-3β在Ser33、Ser37和Thr41位点磷酸化β-Catenin。紧接着,β-Catenin被β-TrCP/Skp通路泛素化后,最终被蛋白酶体降解。
  
  
  
  CST赛信通关于磷酸化抗体p53 Signaling信号通路图
  
  当Wnt配体存在时(ON-state),共同受体LRP5/6被带入复合体与Wnt结合的卷曲蛋白(Frizzled)一起。这样就导致蓬松蛋白(Dvl)相继磷酸化、多聚泛素化和聚合后被激活,并从APC/Axin上将GSK-3β取代。接着,稳定的β-catenin通过Rac1和其他因子转运入核,在胞核内结合LEF/TCF转录因子,启动Wnt/β-catenin靶向基因的表达。
  
  
  
  CST赛信通关于磷酸化抗体Phosphoinositide Signaling信号通路图
  
  总之,β-Catenin作为保守的Wnt/β-Catenin通路(OFF/ON-state)的重要因子,参与调控多种发育和稳态功能(细胞增殖、分化和命运抉择等),推动干细胞的多能性和自我更新。其还作为共激活因子,协助激活那些调控Wnt靶基因表达的TCF/LEF转录因子家族。
  
  正因为β-catenin的活性状态为其非磷酸状态,所以其检测也与一般蛋白不同。为观察β-Catenin的降解情况,CST中国(赛信通)的实验小伙伴分别将Phospho-β-Catenin(Ser33/37/Thr41)抗体(#9561)、Phospho-β-Catenin(Thr41/Ser45)抗体(#9565)与β-Catenin总蛋白抗体组成CP,进行蛋白检测。结果显示,经MDI处理后的各时间点,细胞中总的β-Catenin含量减少,另外,MDI处理24hr后,β-Catenin磷酸化水平升高,说明MDI处理后β-Catenin蛋白降解加剧。然后,,CST中国(赛信通)的实验小伙伴使用#8814检测non-phospho(Active)β-Catenin(Ser33/37/Thr41),有力地证明未被磷酸化、稳定、具有活性的β-catenin含量增加。由此可见,当要观察活性β-Catenin表达水平时,non-phos-β-catenin抗体和β-catenin总蛋白抗体就会成为一对CP喽。另外,由于稳定的β-catenin入核后参与靶基因的转录过程,CST中国(赛信通)的实验小伙伴为观察核内有活性的β-catenin水平,故使用#8814检测了核内non-phospho(Active)β-Catenin(Ser33/37/Thr41),此时,它还与组蛋白组成CP了。CST中国(赛信通)的实验小伙伴还发现,同样与发育相关的YAP靶点,也有类似情况。YAP被广泛认为是Hippo通路的一个中央介导物,从而在组织生长和器官大小的调节中发挥功能性和广泛保守的作用。但是LATS激酶磷酸化YAP许多位点(如Ser127和Ser397),从而导致诱发YAP蛋白酶体降解。如果要检测细胞中具有活性水平的YAP,也需要检测non-YAP(Ser127和Ser397)。
  
  
  
  CST赛信通关于磷酸化抗体Warburg Effect信号通路图
  
  作为我心中的抗体领导者,最后再给大家安利下CST这家公司吧。CST(Cell Signaling Technology ) 是一家由科学家创立的私营家族公司,CST中国(赛信通)是CST在中国建立的独资子公司,致力于提供全球最高品质的创新研究和诊断产品,加速生物学认知以及实现个体化医疗。董增军(Jay Dong)为赛信通CST(全球)副总裁兼亚太总经理。今年是CST成立20周年,CST中国(赛信通)成立11周年,期待他们能有更多的研究成果和诊断产品问世~
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